Dauernd wiederkehrender Fehler bei Assay durchführung! Tipps?

[Murinho_1]

Hallo,

ich führe momentan einen Ca2+ Assay auf einer 96 Well Plate durch.
Die Ergebnisse das Assays sind auch überwiegend gut, jedoch zeigt die Erste (A) und die Letzte Reihe (H) des Assays immer falsche Werte an.
Interessant ist hierbei, auch die + und - Kontrolle haben komplett andere Werte als in den anderen Wells! (Die Werte in Reihe A & H sind alle Höher!)
Wohlgemerkt bei diesem Assay pipettiere ich mit einer Multichannel Pipette. Bei dem überführen der Substanzen ob nun von einer anderen 96-Well Platte oder einem Reservoir achte ich immer stark darauf das alle Pipettenspitzen gleich viel Substanz aufgenommen haben.
Als kleiner Hinweis die Wells der ersten und letzten Zeile werden zeitgleich wie die anderen Wells der Spalte befüllt. (Mit der gleichen Pipette)
Es wird übrigens ein Farbstoff verwendet welcher von Licht geschützt werden muss. Der Assay wird für die Inkubation mit Alufolie abgedeckt.

Ich stehe noch nicht lange im Labor, kann mir jemand gegebenenfalls Tipps nennen, woran es liegen könnte?
Hat jemand schon mal ähnliche Erfahrungen gemacht bei einem Readout? Ausgewertet wird mit einem Gerät welches die Fluoreszenz Aktivität bestimmt.
Ich würde mich über jeden Hinweis freuen!
Manchmal gibt es ja merkwürdige Fehler die andere Leute schon mal gemacht haben, hoffentlich ist jemand von euch dabei mit einer ähnlichen Erfahrung


Grüße
Mourinho

 

[Joffi]

Grundsätzlich sind sogenannte "edge effects" bei Mikrotiterplatten schon ein Thema. Was genau das verursacht, liegt dann konkret am Assay. Faktoren sind gerne Temperatur (man stellt die Platte in einen Wärmeschrank und die heizt sich von außen auf), Gase (zB Sauerstoff diffundiert schneller über die Außenkanten), Licht (offensichtlich).
In Deinem Fall:
- Was genau ist denn Dein Sample? Anorganische Salzlösung? Solubilisierte Zellen? Blut? Sonstwas?
- Was genau ist das Fluorophor? Calcium-Green oder sowas?
- Ist die 96-well Platte beim Assay dabeigewesen oder hast Du die ausgesucht (und wie sieht die aus? klar, weiß, schwarz?)

 

[Murinho_1]

Hallo Joffi,
mein Sample sind Zellen, auf welche ich ein Protein gebe welches die Zellen zerstören soll. Hierbei werden verschiedene Konzentrationen des Proteins in den verschiedenen Spalten eingesetzt. Mein Fluorophor ist Fluo-4. Die 96 Well Platte habe ich selbst ausgesucht und sie ist eigentlich komplett klar. (Ist nicht im Assay enthalten)
Die Platte mit den Zellen + Farbstoff wird 30Minuten im Inkubator und 30 Minuten bei RT inkubiert. Anschließend werden die Konzentrationen des Proteins hinzugeben. Dann kommt es zu weiteren 4 Stunden Inkubation bei RT.
Übrigens, die Werte der Reihe A & H weisen schon nach 2 Stunden Inkubation erhöhte Werte auf. Das habe ich mir mal angeschaut.

Grüße
Mourinho

 

[Joffi]

Hi! Na dann, ran an den Speck Also ganz Offensichtliches sehe ich nicht sofort, aber mit ein paar Kontrollexperimenten kriegst Du das eingekreist.

Schritt 1 wäre, das Assay genau (!) so einmal ohne Zellen zu machen. Wenn da alles stabil bleibt, weißt Du zumindest schon einmal, dass Dein Effekt auf Ebene der Zellen passiert (und nicht Farbstoffbleichung, Lichtreflexe, weiß der Teufel was).
Wenns auch ohne Zellen den Effekt gibt => versuch mal eine schwarze Platte (je nach Eurem Platereader ganz schwarz für top read oder mit klarem Boden für bottom read).
Wenns die Zellen/das Protein sind => jetzt wird haarig, denn das wäre ein klassischer edge effect, der bei Deinem Assay von der Temperatur (außen kühlt schneller auf RT) oder auch dem pH kommen könnte (ich vermute mal, "Inkubator" heisst bei Dir 5% CO2 und "RT" heißt Raumluft => da kippt der Carbonatpuffer von Zellkulturmedien langsam weg, weil CO2 abdampft). Lässt sich kaum reparieren (klar, kannst Dein Medium zusätzlich HEPES puffern, wenn Du die Geduld hast, das zu probieren), wir lassen bei manchen Assays A, H, 1 und 12 komplett weg und machen da nur Puffer rein, bleiben immer noch 60 wells

P.S.: Fällt mir noch ein, schau als aller erstes mal im Mikroskop, dass in A und H auch sicher gleich viele Zellen / gleiche Konfluenz herrscht, sonst ist der edge effect schon in der Zellkultur gewesen....

 

[Murinho_1]

Hallo Joffi,

herzlichen Dank für deine Antwort.
Da hast du mir ja ganz schön viele Sachen an die Hand gegeben die ich testen kann.
Leider bin ich gerade verhindert die Arbeiten direkt in die Tat umzusetzen, aber ich werde dir sobald wie möglich Feedback geben wie sich meine Tests entwickelt haben.

Falls jemand noch weitere Hinweise haben sollte, würde ich mich auch noch über weitere Gedanken/Anregungen freuen.

Grüße
Mourinho

 

[Murinho_1]

Hi! Na dann, ran an den Speck Also ganz Offensichtliches sehe ich nicht sofort, aber mit ein paar Kontrollexperimenten kriegst Du das eingekreist.

Schritt 1 wäre, das Assay genau (!) so einmal ohne Zellen zu machen. Wenn da alles stabil bleibt, weißt Du zumindest schon einmal, dass Dein Effekt auf Ebene der Zellen passiert (und nicht Farbstoffbleichung, Lichtreflexe, weiß der Teufel was).
Wenns auch ohne Zellen den Effekt gibt => versuch mal eine schwarze Platte (je nach Eurem Platereader ganz schwarz für top read oder mit klarem Boden für bottom read).
Wenns die Zellen/das Protein sind => jetzt wird haarig, denn das wäre ein klassischer edge effect, der bei Deinem Assay von der Temperatur (außen kühlt schneller auf RT) oder auch dem pH kommen könnte (ich vermute mal, "Inkubator" heisst bei Dir 5% CO2 und "RT" heißt Raumluft => da kippt der Carbonatpuffer von Zellkulturmedien langsam weg, weil CO2 abdampft). Lässt sich kaum reparieren (klar, kannst Dein Medium zusätzlich HEPES puffern, wenn Du die Geduld hast, das zu probieren), wir lassen bei manchen Assays A, H, 1 und 12 komplett weg und machen da nur Puffer rein, bleiben immer noch 60 wells

P.S.: Fällt mir noch ein, schau als aller erstes mal im Mikroskop, dass in A und H auch sicher gleich viele Zellen / gleiche Konfluenz herrscht, sonst ist der edge effect schon in der Zellkultur gewesen....

Hallo Jofi!

ich konnte mittlerweile diesen Fehler durch eine einfach Maßnahme lösen!
Bevor ich die Möglichkeit hatte deine Vorschläge im Labor zu untersuchen habe ich einige Paper studiert, welche das auftreten solcher Effekte behandelt. Das Paper "A Simple Technique for Reducing Edge Effect in Cell-Based Assays" hat mir eine Lösung geliefert.
Nachdem die Zellen mit dem Farbstoff behandelt wurden, habe ich sie nicht direkt in den Inkubator gestellt, sondern sie erst einmal bei RT inkubiert. Letztendlich führt das zu einer besseren Verteilung der Zellen (Besonders derer an den Kanten, Stichwort Temperatur Gradient).
Das Paper liefert einige weitere Informationen die vielleicht interessant sein könnten, falls du dir es genauer anschauen möchtest kannst du ja einen Blich darüber werfen. Dennoch vielen Dank für deine Antwort.

Vielleicht aber eine weitere Frage die mit diesem Assay zusammenhängt, die du mir womöglich beantworten kannst.
Ich führe diesen Assay nun mehrere Tage nacheinander durch und erhalte leider bei gleichen Bedingungen niedrigere Signale. Diese Entwicklung kann ich mir leider nicht erklären. Grundsätzlich denke ich das verschiedene Faktoren geringe Signale verursachen könnten.
Um mögliche Fehlerquellen zu nennen:

Zerstörung des Farbstoffs: Würde dieser kaputt gehen, würde er niedrigere Werte erzeugen. Jedoch wird dieser im Schnitt alle 3,3 Messungen neu angesetzt wodurch eigentlich nicht die Veränderungen der Werte erklärbar sind. (Farbstoff wird in lichtundurchlässigem Gefäß gelagert. )

Das Medium (Puffer C) geht kaputt, ist es möglich das ein Puffer durch häufiges einfrieren/erwärmen im Wasserbad schlechter wird?
Nach der Verwendung des Puffers friere ich ihn wieder ein. Bei der nächsten Verwendung taue ich diesen wieder auf. Der Puffer enthält viel Calcium, ist hier irgendwas bekannt?

Das zu untersuchende Protein wird schlecht (es soll eine Zelllyse auslösen), aber eigentlich ist dies auszuschließen, da ich oft neue Stocks verwende, und neue stocks keine Besserung zeigen. Auch die Positivkontrolle (Triton X) zeigt immer geringere Werte.

Möglicherweise bleibt die Zellzahl nicht konstant. Ich glaube aber nicht daran, werde das aber morgen untersuchen.
Irgendwelche Tipps vielleicht?


Grüße
Mourinho

 

[Joffi]

Grüß Dich, freut mich zu hören, dass zumindest der edge effect unter Kontrolle ist . Die Schlüsselinformation für die neuen Probleme scheint mir, dass auch die Positivkontrolle geringer ausfällt. Damit ist zumindest Dein Protein vom Tisch. Für die Stabilität der anderen Komponenten bleibt nur ausprobieren, ausprobieren, ausprobieren => erst einmal absolut ALLES frisch ansetzen und schauen, ob die Werte wieder hochkommen. Wenn ja, die einzelnen Komponenten durchtesten, bis klar ist, welche die entscheidende ist, die jedes Mal frisch angesetzt werden muss. Jede kommt irgendwie in Frage: Fluoreszenzfarbstoffe bleichen, Puffer kristallisieren beim freeze-thaw/ziehen CO2 als Carbonat/sickern ins Plastik/whatever usw.. Die Zellzahl sollte natürlich eigenlich nicht immer geringer werden, aber natürlich auch ein Faktor zum Ausschließen. Viel Erfolg!

 

[Murinho_1]

Grüß Dich, freut mich zu hören, dass zumindest der edge effect unter Kontrolle ist . Die Schlüsselinformation für die neuen Probleme scheint mir, dass auch die Positivkontrolle geringer ausfällt. Damit ist zumindest Dein Protein vom Tisch. Für die Stabilität der anderen Komponenten bleibt nur ausprobieren, ausprobieren, ausprobieren => erst einmal absolut ALLES frisch ansetzen und schauen, ob die Werte wieder hochkommen. Wenn ja, die einzelnen Komponenten durchtesten, bis klar ist, welche die entscheidende ist, die jedes Mal frisch angesetzt werden muss. Jede kommt irgendwie in Frage: Fluoreszenzfarbstoffe bleichen, Puffer kristallisieren beim freeze-thaw/ziehen CO2 als Carbonat/sickern ins Plastik/whatever usw.. Die Zellzahl sollte natürlich eigenlich nicht immer geringer werden, aber natürlich auch ein Faktor zum Ausschließen. Viel Erfolg!

Hi,

ja richtig das Protein kann somit ausgeschlossen werden.
Ich habe gestern den Assay mit verschiedenen Zellkonzentrationen( auch höhere und niedrigere als sonst eingesetzt) durchgeführt. Zur Lyse habe ich hierbei jedoch nur Triton verwendet. Die Signalunterschiede zwischen 90.000 & 15.000 Zellen pro Well waren marginal!
Nach der Durchführung des Assays habe ich mir die Zellen mal unter dem Mikroskop näher angeschaut. Mit erschrecken musste ich feststellen das diese zu großen Teilen nicht lysiert sind. Die Zellen wurden relativ frisch (vor 2 Wochen) aus dem flüssigen Stickstoff geholt und in Kultur genommen. Anfangs zeigten die Zellen eine gute Antwort auf den Virulenzfaktor/triton.
Mittlerweile bin ich bei der 6-7 Passage angekommen und die Ergebnisse werden immer schlechter.
Kann es sein, dass ich was mit meiner Zellkultur falsch mache? Können Zellen extrem robust gegen verschiedene Stoffe aufeinmal werden?

Grüße
Mourinho

 

[Joffi]

Welche Zellen sind's denn hier konkret?

 

[Murinho_1]

U937 Zellen