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Dauernd wiederkehrender Fehler bei Assay durchführung! Tipps?

Murinho_1

Einfacher Mehrzeller
Hallo,

ich führe momentan einen Ca2+ Assay auf einer 96 Well Plate durch.
Die Ergebnisse das Assays sind auch überwiegend gut, jedoch zeigt die Erste (A) und die Letzte Reihe (H) des Assays immer falsche Werte an.
Interessant ist hierbei, auch die + und - Kontrolle haben komplett andere Werte als in den anderen Wells! (Die Werte in Reihe A & H sind alle Höher!)

Wohlgemerkt bei diesem Assay pipettiere ich mit einer Multichannel Pipette. Bei dem überführen der Substanzen ob nun von einer anderen 96-Well Platte oder einem Reservoir achte ich immer stark darauf das alle Pipettenspitzen gleich viel Substanz aufgenommen haben.
Als kleiner Hinweis die Wells der ersten und letzten Zeile werden zeitgleich wie die anderen Wells der Spalte befüllt. (Mit der gleichen Pipette)
Es wird übrigens ein Farbstoff verwendet welcher von Licht geschützt werden muss. Der Assay wird für die Inkubation mit Alufolie abgedeckt.

Ich stehe noch nicht lange im Labor, kann mir jemand gegebenenfalls Tipps nennen, woran es liegen könnte?
Hat jemand schon mal ähnliche Erfahrungen gemacht bei einem Readout? Ausgewertet wird mit einem Gerät welches die Fluoreszenz Aktivität bestimmt.
Ich würde mich über jeden Hinweis freuen!
Manchmal gibt es ja merkwürdige Fehler die andere Leute schon mal gemacht haben, hoffentlich ist jemand von euch dabei mit einer ähnlichen Erfahrung :D


Grüße
Mourinho
 

Joffi

Moderator
Moderator
Grundsätzlich sind sogenannte "edge effects" bei Mikrotiterplatten schon ein Thema. Was genau das verursacht, liegt dann konkret am Assay. Faktoren sind gerne Temperatur (man stellt die Platte in einen Wärmeschrank und die heizt sich von außen auf), Gase (zB Sauerstoff diffundiert schneller über die Außenkanten), Licht (offensichtlich).
In Deinem Fall:
- Was genau ist denn Dein Sample? Anorganische Salzlösung? Solubilisierte Zellen? Blut? Sonstwas?
- Was genau ist das Fluorophor? Calcium-Green oder sowas?
- Ist die 96-well Platte beim Assay dabeigewesen oder hast Du die ausgesucht (und wie sieht die aus? klar, weiß, schwarz?)
 

Murinho_1

Einfacher Mehrzeller
Hallo Joffi,
mein Sample sind Zellen, auf welche ich ein Protein gebe welches die Zellen zerstören soll. Hierbei werden verschiedene Konzentrationen des Proteins in den verschiedenen Spalten eingesetzt. Mein Fluorophor ist Fluo-4. Die 96 Well Platte habe ich selbst ausgesucht und sie ist eigentlich komplett klar. (Ist nicht im Assay enthalten)
Die Platte mit den Zellen + Farbstoff wird 30Minuten im Inkubator und 30 Minuten bei RT inkubiert. Anschließend werden die Konzentrationen des Proteins hinzugeben. Dann kommt es zu weiteren 4 Stunden Inkubation bei RT.
Übrigens, die Werte der Reihe A & H weisen schon nach 2 Stunden Inkubation erhöhte Werte auf. Das habe ich mir mal angeschaut.

Grüße
Mourinho
 

Joffi

Moderator
Moderator
Hi! Na dann, ran an den Speck :) Also ganz Offensichtliches sehe ich nicht sofort, aber mit ein paar Kontrollexperimenten kriegst Du das eingekreist.

Schritt 1 wäre, das Assay genau (!) so einmal ohne Zellen zu machen. Wenn da alles stabil bleibt, weißt Du zumindest schon einmal, dass Dein Effekt auf Ebene der Zellen passiert (und nicht Farbstoffbleichung, Lichtreflexe, weiß der Teufel was).
Wenns auch ohne Zellen den Effekt gibt => versuch mal eine schwarze Platte (je nach Eurem Platereader ganz schwarz für top read oder mit klarem Boden für bottom read).
Wenns die Zellen/das Protein sind => jetzt wird haarig, denn das wäre ein klassischer edge effect, der bei Deinem Assay von der Temperatur (außen kühlt schneller auf RT) oder auch dem pH kommen könnte (ich vermute mal, "Inkubator" heisst bei Dir 5% CO2 und "RT" heißt Raumluft => da kippt der Carbonatpuffer von Zellkulturmedien langsam weg, weil CO2 abdampft). Lässt sich kaum reparieren (klar, kannst Dein Medium zusätzlich HEPES puffern, wenn Du die Geduld hast, das zu probieren), wir lassen bei manchen Assays A, H, 1 und 12 komplett weg und machen da nur Puffer rein, bleiben immer noch 60 wells :)

P.S.: Fällt mir noch ein, schau als aller erstes mal im Mikroskop, dass in A und H auch sicher gleich viele Zellen / gleiche Konfluenz herrscht, sonst ist der edge effect schon in der Zellkultur gewesen....
 

Murinho_1

Einfacher Mehrzeller
Hallo Joffi,

herzlichen Dank für deine Antwort.
Da hast du mir ja ganz schön viele Sachen an die Hand gegeben die ich testen kann.
Leider bin ich gerade verhindert die Arbeiten direkt in die Tat umzusetzen, aber ich werde dir sobald wie möglich Feedback geben wie sich meine Tests entwickelt haben.

Falls jemand noch weitere Hinweise haben sollte, würde ich mich auch noch über weitere Gedanken/Anregungen freuen.

Grüße
Mourinho
 
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