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Expression-Nachweis von Taq-Polymerase: Oligo-(dt)-Primer während der RT-PCR

#1
Guten Tag,





Zusammengefasst wurde mein Projekt im Bereich der Molekularbiologie von April bis Juni so durchgeführt:




Es ging um die Expression-Nachweis von Taq-Polymerase in einem Stamm von E.coli, der das Gen für dieses Protein trägt. Nach dem Zell-Anzucht wurde die mRNA extrahiert und anschließend wurde die genomic DNA mit der DNase I verdaut. Danach wurde eine RT-PCR mit Oligo-(dt)18-Primer durchgeführt. An dieser Stelle haben wir übersehen, dass Oligo-(dt)18-Primer wegen der Kette von 12-20 Deoxythymidinen nur für die eukaryotischen Zellen spezifisch ist. Danach wurden zwei PCR mit den 2 eigenen designten Primer-Paare für das Taq-Polymerase-Gen durchgeführt und wurden die gewünschten Produktgröße (Gel-Elektrophorese) erhalten.


Wie gesagt, wurden die Oligo-(dt)18-Primer für die Umschreibung der mRNA in cDNA verwendet und dieser Schritt hätte funktioniert, obwohl E. Coli ein Prokaryote ist (Das würde beudeutet, dass die mRNA keine Poly-(A)-Schwänze, an die sich Oligo (dT) -Primer mit der 12-20 Deoxythymidinen-Kette anlagern können).




Hätte jemand eine Erklärung für diese Ergebnisse? Oder ein Paper, wo es darüber diskutiert wurde?



Liebe Grüße

Jules.
 

Joffi

Moderator
Moderator
#2
Hallo Jules,

mehrere Möglichkeiten:
1. Viele cDNA-Synthese-Kits enthalten auch random hexamers, manchmal sogar gemischt mit den polyT-Primern (Qiagen macht das zB). Das müsstest Du für Euer Kit sicher ausschließen (Kit-Anleitung studieren).
2. Polyadenylierung von Transkripten ist in Bakterien vielleicht nicht die Regel, aber auch nicht ausgeschlossen. Hier ein Paper dazu: Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Apr 25; 92(9): 3973–3977. Polyadenylylation destabilizes the rpsO mRNA of Escherichia coli. E Hajnsdorf, F Braun, J Haugel-Nielsen, and P Régnier
3. Die kleinste Zufallsüberlappung von polyT-Primern mit einer Serie von A's irgendwo im 3'-Bereich Deines Zieltranskriptes kann zu einer cDNA-Synthese führen. Primer müssen nur mit einigen ihrer vordersten Nukleotide Bindung aufnehmen, das reicht für effizientes Priming auch wenn da ein langer Teil des Primers hinten in der Luft baumelt.

Was dabei?
 

Joffi

Moderator
Moderator
#4
Das ist denkbar, ja. Die Menge an cDNA ist dann natürlich nicht mehr quantitativ proportional zur Transkriptabundanz, aber für die qualitative Detektion per PCR reicht ja nun theoretisch ein einziges Molekül.
 
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