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Expression von Taq-Polymerase: RT-PCR mit Oligo-(dt)18 für mRNA im eukaryotischen Zellen.

Guten Tag,





Zusammengefasst wurde mein Projekt im Bereich der Molekularbiologie von April bis Juni so durchgeführt:




Es ging um die Expression-Nachweis von Taq-Polymerase in einem Stamm von E.coli, der das Gen für dieses Protein trägt. Nach dem Zell-Anzucht wurde die mRNA extrahiert und anschließend wurde die genomic DNA mit der DNase I verdaut. Danach wurde eine RT-PCR mit Oligo-(dt)18-Primer durchgeführt. An dieser Stelle haben wir übersehen, dass Oligo-(dt)18-Primer wegen der Kette von 12-20 Deoxythymidinen nur für die eukaryotischen Zellen spezifisch ist. Danach wurden zwei PCR mit den 2 eigenen designten Primer-Paare für das Taq-Polymerase-Gen durchgeführt und wurden die gewünschten Produktgröße (Gel-Elektrophorese) erhalten.


Wie gesagt, wurden die Oligo-(dt)18-Primer für die Umschreibung der mRNA in cDNA verwendet und dieser Schritt hätte funktioniert, obwohl E. Coli ein Prokaryote ist (Das würde beudeutet, dass die mRNA keine Poly-(A)-Schwänze, an die sich Oligo (dT) -Primer mit der 12-20 Deoxythymidinen-Kette anlagern können).




Hätte jemand eine Erklärung für diese Ergebnisse? Oder ein Paper, wo es darüber diskutiert wurde?



Liebe Grüße

Jules.
 
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