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Gelchromatographie - Entsalzen von Rinderserumalbumin

bilufi

Reptil
Hallo,

ich habe im Praktikum eine Gelchromatographie gemacht (Entsalzen von Rinderserumalbumin).
So. Wir haben also die Probe auf die Säule aufgetragen und durchlaufen lassen und in Fraktionen aufgefangen. Dann haben wir die Extinktionen bestimmt und somit herausgefunden, in welchen Fraktionen das Rinderserumalbumin war. Dann haben wir in die Reagenzgläser Salpetersäure und Silbernitrat gegeben, und dann hat sich bei den Rgg in denen sich NaCl befand, eine Trübung gezeigt.
So schön so gut.
Jetzt ist es leider so, dass in den Rgg in denen das Rinderserumalbumin war, teilweise auch die Trübung (deutlich) war. D.h. ja, dass einige NaCl Moleküle doch schneller durch die Säule gelaufen sind, als normal.
Weiß jemand, woran das liegen kann?
Danke schonmal,
birgit
 
Hallo,

das kann natürlich an diversen Dingen liegen. Nach deiner Schilderung würde ich allerdings darauf tippen, daß die Trennung des RSA vom NaCL über die Säule nicht vollständig war und somit ein Teil des Salzes in der Proteinfraktion verblieben ist. Dies kann z.B. folgenden Grund haben: Das aufgetragene Probenvolumen war zu groß für die benutzte Säule. Wieviel Probenvolumen eine Gelchromatographiesäule trennen kann, hängt davon ab, mit wieviel Gelmaterial sie "gepackt" wurde. Das kann man ausrechnen. Ist sie gepackt, muß sie qualifiziert werden, sprich man muß herausfinden, wieviel Probenvolumen sie auftrennen kann. Interessanterweise macht man das, z.B. mit einer 0,5 M NaCL/0,2%igen RSA - Lösung :). Ich weiß ja nicht ob euer Lehrer die Säule gepackt, qualifiziert und dann seine Praktikumsvorschrift für euch entsprechend angepasst hat, so daß eine klare Trennung des hochmolekularen Albumins vom niedermolekularen Salz auch wirklich gewährleistet ist, aber für mich hört sich das alles stark nach einer "überladenen" Säule an. Kannst deinen Lehrer/in ja mal drauf ansprechen.

So, vielleicht konnt ich dir ja helfen. Wenn du weitere Fragen hast...nur zu. :)

Gruß Thorsten
 

bilufi

Reptil
super, vielen Dank für die ausführliche Antwort!
Also ich werd mal meinen Lehrer drauf ansprechen. Obwohl der Versuch eigentlich von mehreren durchgeführt wurde, und ich glaube, bei denen gabs auch eine vollständige Trennung... Da werd ich nochmal die anderen fragen.:)
 
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