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Gelelektrophorese mit Plasmiden

Cruiser

Komplexer Mehrzeller
#1
Hi. Wir haben eine Gelelektrophorese nach einer Restriktion (Doppelverdau) durchgeführt. Meiner Ansicht nach müssten sich daraus 2 Banden ergeben, da ein Stück des Plasmides herausgeschnitten wird. Bei uns hat das ganze nicht funktioniert :( (zu viele Banden zu sehen). Meine Frage ist aber eigentlich: Wie kann es passieren, dass ich vor der Restriktion ein Plasmid hatte, dass laut Marker/Standard eine Größe von 6000 bp hatte und nach der Restriktion werden 8000 bp angezeigt? Da finde ich echt keine Lösung. Wäre ganz lieb, wenn jemand eine Idee hätte..
 

Joffi

Moderator
Moderator
#2
Eine Möglichkeit ist ein inkompletter Verdau. Dann laufen Plasmide in allerlei verschiedenen Größen, die nicht unbedingt ihre Länge wiedergeben (ringförmig entspannt vs. supercoiled vs. gebrochen). Dazu noch Deine Schnittprodukte, voila. Könnte das sein?
 

Cruiser

Komplexer Mehrzeller
#3
Wir hatten vorher mit den isolierten Plasmiden schon eine Gelelektrophorese durchgeführt. Dabei waren 2 Banden entstanden. Eine bei 5000 und eine bei 6000 bp, bei denen ich von supercoiled und offenkettig ausging. Und dann wäre die Wanderung zu 8000 bp damit nicht erklärbar.
Bei der 2. Gelelekrophorese (also die mit dem Verdau) ließen wir bei niedrigerer Spannung länger laufen, um ein exakteres Ergebnis zu bekommen. Kann es sein, dass die offenkettige Form (6000 bp, da diese ja anscheinend langsamer wandert) aufgrund der anderen Spannung vielleicht noch mehr wiederstand entwickelt und noch langsamer läuft?
 

Joffi

Moderator
Moderator
#4
Unwahrscheinlich, dass supercoiled so groß aussieht, knallt normalerweise ordentlich schnell durchs Gel, vielleicht die anderen beiden Formen. Ob die mit unterschiedlicher Abhängikeit von der Spannung wandern... wow... nie ausprobiert. Möglich wär's.
Im Zweifelsfall heisst die Devise immer: nochmaaaaal :) Wenn die Banden deutlich zu sehen waren bei nicht übermäßiger Belichtung, einfach mal weniger DNA reinballern und etwas länger inkubieren, um einen inkompletten Verdau auszuschließen.
 

Cruiser

Komplexer Mehrzeller
#5
Okay, dankeschön schonmal.
Nochmal würde ich es gerne machen;) Hatte aber leider nur ein Praktikum und für das Protokoll sollen wir uns mögliche Ursachen für die Ergebnisse aus den Fingern saugen;)