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Knockout bei Tieren

#1
Hallo:)
ich habe bald meine Masterprüfung und soll u.a. das Verfahren erklären, wie knockout-Mäuse hergestellt werden. Da ich bis jetzt nur mit Bakterien gearbeitet habe, habe ich versucht im Internet und einigen Büchern was zu finden...Daraus werde ich aber nicht schlau. Wenn ich das richtig verstanden habe werden embryonale Stammzellen aus einer Blastocyste entnommen, denen ein Vektor eingesetzt wird. Über homologe Bereiche wird dann ein Antibiotikarasistenzgen in das Mausgenom eingebracht. Dazu wird eine Neomycinresistenz verwendet, die auch als Selektionsmarker dient, um erfolgreich transfizierte embryonale Stammzellen herauszufinden. So weit ich weiß, ist bindet Neomycin an die 30s UE der Ribosomen von Bakterien...die sind doch nicht in einer Mauszelle vorhanden...Oder hab ich das alles falschverstanden? Gibt es sonst noch was wichtiges, was ich wissen sollte? Vielen Dank schon mal für die Hilfe!
 

Joffi

Moderator
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#2
Grüß Dich!

Wenn ich das richtig verstanden habe werden embryonale Stammzellen aus einer Blastocyste entnommen, denen ein Vektor eingesetzt wird.
=> In der Realität werden diese Stammzellen in Kultur propagiert und müssen nicht jedesmal neu entnommen werden. Aber da kommen sie her, ja.

Über homologe Bereiche wird dann ein Antibiotikarasistenzgen in das Mausgenom eingebracht. Dazu wird eine Neomycinresistenz verwendet, die auch als Selektionsmarker dient, um erfolgreich transfizierte embryonale Stammzellen herauszufinden. So weit ich weiß, ist bindet Neomycin an die 30s UE der Ribosomen von Bakterien...die sind doch nicht in einer Mauszelle vorhanden...Oder hab ich das alles falschverstanden?
=> Dosisabhängig ist Neomycin auch für Säugerzellen toxisch, also im Prinzip alles verstanden. Das Zauberwort heisst hier "homologe Rekombination", vielleicht nochmal nachschlagen. In der klassischen Variante wird außerhalb der Homologiearme noch ein Gen für die Thymidinkinase eingesetzt. Dann kann man mit Neomycin auf Zellen selektionieren, die den Vektor reinrekombiniert haben und mit Thymidinanalogen alle diejenigen umbringen, die nicht-homolog sonstwie integriert sind.
Entscheidend ist natürlich noch, WO man hier WAS reinrekombiniert. Am Ende soll ja ein Knockout entstehen. Beliebt ist es, die Neomycin-Kassette so in einem Gen zu platzieren, dass kein funktionelles Transkript mehr entstehen kann.

Gibt es sonst noch was wichtiges, was ich wissen sollte?
=> An der Stelle gehts dann eigentlich erst los :). Jetzt muss man die transfizierten Stammzellen in eine Blastozyste injizieren (die man erstmal aus einer trächtigen Maus holen muss), diese dann in eine scheinträchtige Maus implantieren und austragen lassen. Unter den entstehenden Nachkommen muss man diejenigen identifizieren, bei denen die transfizierten Stammzellen zufällig in den Geschlechtsorganen gelandet sind und dort Keimzellen bilden. Diese Tiere wiederum kann man jetzt auf den gewünschten Mausstamm-Hintergrund auskreuzen.

Wenn sich da noch Fragen ergeben, frag gern noch einmal nach. Ansonsten viel Erfolg für die Prüfung!
 
#3
Danke für deine Antwort!
Ich verstehe nicht warum Neomycin auch für Säugerzellen toxisch ist. Bindet es da auch an die kleine ribosomale Untereinheit? Also hat es genau die gleiche Wirkung wie bei Bakterien, obwohl die ribosomalen Untereinheiten nicht gleich sind? Wie funktioniert das?