Northern Blot

[Seven]

Hallo,
ich bin neu in diesem Forum und kenne mich noch nicht so gut aus, also entschuldigt bitte, wenn ich im flaschen Bereich poste.

Ich muss am Dienstag ein Referat halten.
Das Thema "Northern Blot"
Es gibt ne Menge (ist noch wenig ausgedrückt) über den Southern Blot, aber ich finde so gut wie garnix über den Northern Blot. Ich werde von einer UNI Seite zur anderen geschickt, von einer PDF Datei in die nächste.

Vorallem finde ich nix zu den vom Lehrer gegeben Stichwörtern. Die wären:
-Isolierung von RNA; Unterschiede zur DNA Isolierung
-Auftrennung im Agarosegel
-Übertragung der RNA auf eine Membran
-Hybridisierung mit einer markierten Gensonde und deren Nachweis


Ich hoffe ich kann auf euch zählen

 

[Brucei]

Hallo!

Also prinzipiell sind der Southern- und der Northern-Blot von der Art der Durchführung sehr ähnlich, wenn nicht sogar gleich. Beim Southern verwendet man DNA beim Northern halt RNA.
Isolierung von RNA: Nach Zellaufschluss, meist in einem Medium mit Detergenzien, werden die Nukleinsäuren entweder durch Ausschütteln mit Phenol/Chloroform und anschließender Zentrifugation von den anderen Zellbestandteilen (Proteine, Lipide, etc) getrennt. DNA wird anschließend durch Zugabe von RNase-freier DNase abgebaut. Allerdings gibts hier noch viele verschiedene andere Methoden zur Isolierung von RNA. Was zu erwähnen ist, ist das RNA viel instabiler und somit noch "behutsamer" zu behandeln ist als DNA.
Die Auftrennnung im Agarosegel, die Übertragung auf eine Membran und das markieren durch eine Sonde sind analog zum Southern-Blot.

 

[Joffi]

Brucei hats ja schon super beschrieben, ich füge nur noch schnell ein paar Details dazu: Der Unterschied bei der "klassischen" Aufreinigung von RNA vs. DNA ist u.a. der pH-Wert des verwendeten Phenols und die mechanische Belastung der Probe. Mit letzteren meine ich: Wenn ich einen Gewebebrocken mit Proteinasen auflöse, bekomme ich intakte DNA, wenn ich ihn mit einer Art superschnellen Stabmixer zerschreddere, zerbreche ich die DNA in kleine, wertlose Stückchen und kann getrost RNA isolieren.

 

[Seven]

Brucei hats ja schon super beschrieben, ich füge nur noch schnell ein paar Details dazu: Der Unterschied bei der "klassischen" Aufreinigung von RNA vs. DNA ist u.a. der pH-Wert des verwendeten Phenols und die mechanische Belastung der Probe. Mit letzteren meine ich: Wenn ich einen Gewebebrocken mit Proteinasen auflöse, bekomme ich intakte DNA, wenn ich ihn mit einer Art superschnellen Stabmixer zerschreddere, zerbreche ich die DNA in kleine, wertlose Stückchen und kann getrost RNA isolieren.

Vielen Dank für eure Anworten ! Bisher sinds die freundlichsten und die besten

Eine Frage hätte ich aber noch:

Was sind RNasen und Proteinasen ?
Was sind Detergenzien ?
Was bedeutet „Detektion“


"DNA wird anschließend durch Zugabe von RNase-freier DNase abgebaut"
Warum, könnt ihr mir in 1-2 Sätzen vllt beschreiben warum ?

"Isolierung von RNA: Nach Zellaufschluss, meist in einem Medium mit Detergenzien, we....."
Wie geschieht dieser zellaufschluss ?

Ihr habt mich schon 100% weitergebracht, diese Fragen noch und dem gelnigen steht nichts mehr im Wege.

Bis hierhin vielen Danke !

 

[Seven]

So eure und weitere Hilfen haben mich um einiges weiter gebracht Very Happy
Vielen dank, für eure tatkräftige Unterstützung. Es ist spät und ich hoffe ich kann euch noch um eine Sache bitten. Ja, mein Referat ist fertig. Alles geschrieben und auch verstanden. Die Frage die bleibt ist nur, ist das auch richtig was ich geschrieben.

Ich hänge die Word Datei an und bitte jemanden sich das mal anzuschauen, wenns eure zeit zu lässt udnd falls es nicht zu grosse Umstände bereitet, ein wenig zu korrigieren. Hört sich vllt etwas vermessen an, aber bei einigen Quellen war ich mir nicht ganz sicher.

So nun aber die Datei und einen schönen Abend wünsche ich euch noch

Ein Link zur Datei, da die Funktion des hochladen nur in dem Forum möglich war....

{Ich habe die Einstellungen geändert und die Datei unten angehängt - Gruß, mik ;-}

Ich entschuldige mich für den doppel Post.

 

[Joffi]

Hallo Seven! Sehr schöner Text, gefällt mir. Im Folgenden ein paar Anmerkungen ("..." sind Zitate von Dir, dahinter meins):

"Die zu untersuchende RNA wird mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen behandelt" Dieser Schritt ist für einen Northern unnötig, der geschieht nur beim Southern, da genomische DNA so lang ist. RNA ist ohnehin schon viel kürzer und muss nicht geschnitten werden.

"entweder durch Ausschütteln mit Phenol/Chloroform" in dem Satz fehlt das "oder", das immer hinter einem "entweder" kommen muss

"DNA wird anschließend durch Zugabe von RNase abgebaut." RNasen bauen RNA ab, DNasen DNA, daher macht der Satz so keinen Sinn. DNasen bauen DNA ab, willst Du sagen.

"Wenn ich einen Gewebebrocken mit Proteinasen auflöse, bekomme ich intakte DNA, wenn ich ihn mit einer Art superschnellen Stabmixer zerschreddere, zerbreche ich die DNA in kleine, wertlose Stückchen und kann getrost RNA isolieren." Ich freue mich, dass Dir meine Formulierung so gut gefallen hat . Allerdings ist das etwa schluderig formuliert für Deinen Text. Versuchs mal etwas seriöser zu formulieren, als ich es gemacht hab.

"Schritte:" in dem Kapitel verwechselst Du konsequent DNA und RNA
"Blot-Methoden": in diesem hier auch

"Eine DNA-Bande kann aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA zur weiteren Verwendung aus dem Gel aufgereinigt werden" Das ist zwar richtig, aber Du machst hier ja ein RNA-Gel und keni DNA-Gel. Und RNA-Banden schneidet man in der Regel nicht aus. Einfach weg mit dem Satz, ist für Northern Blot unwichtig.

Dann beschreibst Du noch zwei Methoden zur Sonden-Herstellung. Ich füge eine dritte hinzu: Man kann mit dem Enzym Polynukleotidkinase ein Phosphat von einem ATP auf das 5'-Ende der Sonde übertragen. Dazu braucht man entsprechend gamma-[32P]-ATP (das gamma bezieht sich auf die Position des radioaktiven Phosphats: äußerste Position).

Ich hoffe, ich konnte Dir etwas helfen.

Gruß,

Tobias

 

[Seven]

Danke Dir, ich hoffe du kommst heute nochmal On und schaust in den Thread, falss ich noch eine Frage habe. Danke für deine Zeit, danke für den Aufwand, danke das jemand, das Du da bist um mir zu helfen.
Danke für deine Experten Hilfe.

 

[Seven]

Ich habe nun mein Referat vervollständigt und denke es macht einen guten Eindruck. Ich bin es nun am Enden, nach dem ich eure Ratschläge bedacht und eingebaut habe, noch einmal durchgegangen und versuchte mir alles klar zu machen, dass was ich nicht verstanden habe möchte ich gerne noch einmal an euch richten:

„Auftrennung im Agarosegel. Die Methode nennt sich Agarose-Gelelektrophorese. Ein Verfahren um Stränge nach ihrer Größe zu trennen und um ihre Größe durch Vergleich mit Strängen bekannter Größe zu bestimmen.“

Warum vergleicht man die Grösse der Stränge mit anderen Strängen?
Welchen Sinn hat das für den späteren verlauf der Untersuchung?
_________________________________________________________

„In den Proben, die in die Slots einpipettiert sind, befinden sich Blaumarker. Diese Marker sind auf dem Gel sichtbar und zeigen an, wann die Elektrophorese beendet werden muss.“

Wie zeigen sie das an, woran sehe ich das?
Etwa Farbveränderung, wodurch ?
_________________________________________________________

„Die eigentliche Färbung der Banden erfolgt erst nach der Elektrophorese mit entweder Ethidiumbromid oder AzurB-Chlorid. Die Banden werden dann durch UV-Licht sichtbar gemacht.“

Wozu verfärbt man die Banden?
Wenn man sie verfärbt, warum werden sie dann erst unter UV Licht sichtbar?


Kommen in alle 3 Slots Blau-Marker oder nur in den zweiten und dritten ?
Kommt in den zweiten und dritten Slot auch RNA-Leiter hinein ?
_________________________________________________________

Mir wurde eine weitere Hybridiesierungs Methode nahe gelegt:
„Man kann mit dem Enzym Polynukleotidkinase ein Phosphat von einem ATP auf das 5'-Ende der Sonde übertragen. Dazu braucht man entsprechend gamma-[32P]-ATP (das Gamma bezieht sich auf die Position des radioaktiven Phosphats: äußerste Position.“
Ok und wenn man nun dieses gamma 32P-ATP auf das 5’ Ende gelegt hat, was dann ?

Verständnisfragen:
Was sind Detergenzien?
Was bedeutet Denaturiert?

Mein Fertiges Referat, ein abschliessender Blick: siehe Anhang

 

[Joffi]

Meine Kommentare fangen mit "***" an. Gruß, Tobais

„Auftrennung im Agarosegel. Die Methode nennt sich Agarose-Gelelektrophorese. Ein Verfahren um Stränge nach ihrer Größe zu trennen und um ihre Größe durch Vergleich mit Strängen bekannter Größe zu bestimmen.“
Warum vergleicht man die Grösse der Stränge mit anderen Strängen?
Welchen Sinn hat das für den späteren verlauf der Untersuchung?
***Im Grunde ist das nicht soooo immens wichtig und häufig wird es auch weggelassen. Wenn man das macht, kann man später abschätzen, wie lang die spezifisch durch Hybridisierung sichtbar gemachte Bande ist. Und entsprechend, ob diese Bande überhaupt die gewünschte Ziel-mRNA sein KANN.

„In den Proben, die in die Slots einpipettiert sind, befinden sich Blaumarker. Diese Marker sind auf dem Gel sichtbar und zeigen an, wann die Elektrophorese beendet werden muss.“
Wie zeigen sie das an, woran sehe ich das?
Etwa Farbveränderung, wodurch
***Nein. Derartige Farbstoffe bewegen sich genauso im Gel wie Nukleinsäuren auch, nur dass man sie sehen kann. Wenn ich also weiss, Farbe XY läuft so schnell wie 300 Basen DNA, kann ich den Strom abschalten, wenn das Zeug etwas über die Hälfte durchs Gel gelaufen ist.

„Die eigentliche Färbung der Banden erfolgt erst nach der Elektrophorese mit entweder Ethidiumbromid oder AzurB-Chlorid. Die Banden werden dann durch UV-Licht sichtbar gemacht.“
Wozu verfärbt man die Banden?
Wenn man sie verfärbt, warum werden sie dann erst unter UV Licht sichtbar?
***Im Grunde auch einer dieser Schritte, den man auch mal weglassen könnte. Wenn man das macht, tut man es vor allem, um 1.) die Qualität der RNA zu testen (=ob sie zerfallen ist) und 2.) um zu prüfen, ob alle Spuren gleich aussehen (so sollte es sein). Die verwendete Farbe leuchtet nur unter UV-Licht.

Kommen in alle 3 Slots Blau-Marker oder nur in den zweiten und dritten ?
***Kann man in alle reinmachen oder auch nur in ein paar nach Wunsch, das ist völlig wurscht (vgl. den Sinn des Farbstoff, s.o.)
Kommt in den zweiten und dritten Slot auch RNA-Leiter hinein ?
***Nein! Leiter kommt nur in Slots, wo keine Probe ist! (übrigens sich diese Anglizismen furchtbar, sagen wir doch "Tasche" statt Slot )

Mir wurde eine weitere Hybridiesierungs Methode nahe gelegt:
„Man kann mit dem Enzym Polynukleotidkinase ein Phosphat von einem ATP auf das 5'-Ende der Sonde übertragen. Dazu braucht man entsprechend gamma-[32P]-ATP (das Gamma bezieht sich auf die Position des radioaktiven Phosphats: äußerste Position.“
Ok und wenn man nun dieses gamma 32P-ATP auf das 5’ Ende gelegt hat, was dann ?
***Nun, man will seine Sonde ja irgendwie radioaktiv machen. Entweder so wie Du´s beschrieben hast mit dem Klenow-Fragment oder eben wie bei mir mit PNK. Hauptsache am End ist radioaktives Phosphat in der Sonde.

Verständnisfragen:
Was sind Detergenzien?
***Das sind Moleküle, die ein lipophiles und ein hydrophiles Ende haben. So können sie lipophile Substanzen umlagern und wasserlöslich machen. Seife z.B. ist so etwas (im Labor dann eher SDS, TritonX, Tween20 etc.pp.)
Was bedeutet Denaturiert?
***Das bedeutet im Grunde soviel wie abgebaut, zerfallen, kaputt, schrott. Seine natürlichen Eigenschaften verloren habend (grausames Deutsch, ich weiß). Im Zusammenhang mit RNA spricht man aber eher von degradiert, d.h. zerbröselt in kleine Stücke.

 

[Seven]

Also bei soviel hilfe, nochmal von mir ein ganz dickes DANKE SCHÖN. Gestern/ Dienstag war also der Tag des Vortrags, mein Lehrer schien mir einen guten Eindruck bekommen zu haben, ich bin zuversichtlich.

Danke Joffi aka Tobias das du immer so ausführlich meine Fragen beantwortet hast und mich auf dem Gebiet vorran brachtest. Deine Infos waren wirklich Gold wert

Wünsche noch einen schönen Abend.

LG