Overlap-Extension-PCR

[molmaus]

Hallo,
Ich habe eine Frage zum Prinzip der Overlap Extension PCR. Ich habe gelesen, dass die flankierenden Primer bzw. die Primer mit der Mutation hier die Enden der neu synthetisieren Fragmente markieren. Allerdings verstehe ich nicht, wie es genau hier zum Stopp der Strangsynthese kommt? Bzw. warum wird nicht der komplette Plasmid-Strang neu synthetisiert?
Vielen Dank im Voraus!

 

[Joffi]

Diese Methode ist recht vielseitig, d.h. um Deine Frage genau zu verstehen, müsstest Du das vielleicht kurz anskizzieren. Ich versuchs jetzt mal auf die Gefahr hin, Dich falsch verstanden zu haben: in Deinem Fall ist die template DNA ein zirkuläres Plasmid und da liegen zwei Primer drauf mit dem freischwingenden Überhang hinten dran (=an ihrem jeweiligen 5'-Ende), soweit richtig? Und Deine Frage ist jetzt, warum die Polymerase ausgehend von einem der Primer nicht fröhlich im Kreis weitersynthetisiert, sondern ein PCR-Produkt definierter Länge macht, richtig?
Wenn ja: die Frage trifft auf jede PCR, da ja das template quasi immer länger ist als die Primerbindestellen. Im ersten Zyklus überschießt die Polymerase auch tatsächlich und baut einen so langen Strang, wie sie kann. Ab dem zweiten Zyklus wird es dann interessant, weil jetzt der andere Primer auf diesem "zu langen" Produkt bindet, aber die Pol jetzt tatsächlich nur bis zum ersten Primer fahren kann (weil da ja Ende ist = da hat die Pol im Zyklus vorher angefangen). So kriegen wir ab dem 2. Zyklus jetzt die ersten Fragmente mit der gewünschten Länge und die sind jetzt die Basis für exponentielles Wachstum in den Folgezyklen.

 

[molmaus]

Genau, jetzt hab ich’s verstanden vielen Dank!