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PCR Verunreinigung

Wo liegt die Verunreinigung am wahrscheinlichsten?

  • HPLC Wasser

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  • dNTPS

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  • Primer

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  • PCR Komponenten

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  • Taq Polymerase

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  • Sonstiges

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Gecko

Einzeller
#1
Hallo alle miteinander,
Ich bin neu in diesem Forum und hätte da Mal eine Frage.
Zunächst ein paar Informationen:
Ich schreibe bzw bastel zur Zeit an meiner Diplomarbeit in der Limnologie und untersuche hierfür Quellorganismen (Dunkelmücken) anhand von Cytochrom Ox. 1 und Wingnut Sequenzen.
Solangesam komme ich zum Ende und muss nur noch ein paar Proben abarbeiten aber die PCR-Götter scheinen mit einem bösen Voodoo Steine in meinen Weg zu werfen.

Letzte Woche versuchte ich die letzten 5 Proben zu amplifizieren (Co1 und WG) aber es zeigten sich Doppelbanden, Schmiere Wolken das ganze Paket an Dingen die man nicht auf einem Gel sehen will.
Die PCr Programme kenn ich grad nicht auswendig (bin daheim) haben aber bislang immer gute Banden / Sequenzen erzeugt.

Hab testweise mal eine Probe sequenzieren lassen und die Ergebnisse zeigten, dass da wohl 3 Proben drin wären... Also hab ich mal 2 Negativproben zusammengemixed und aufgetragen, wobei ich 2 verschiedene HPLC Wasser als negativ probe genutzt habe. Die eine war alliquotiert aus der großen Flasche und definitiv steril, die zweite die Probe die ich in jeden Mastermix anwende. Das Ergebnis seht ihr in dem ersten Bild.

Da es wohl nicht an dem Wasser liegt habe ich mehrere Negativproben mit anderen zusammensetzungen angefertigt und in die PCR eingesetzt. Das Ergebnis seht ihr in Bild 2.
Zur Erklärung von Bild 2
1 = alte PCR Komponenten mit Primerpaar COHCOL für CO1 Sequenzen
2 = neue PCR Komponenten mit Primerpaar COHCOL für CO1 Sequenzen
3 = alte PCR Komponenten mit altem Primerpaar WG für Wingnut Sequenzen
4 = neue PCR Komponenten mit altem Primerpaar WG für Wingnut Sequenzen
5 = alte PCR Komponenten mit neuem Primerpaar WG für Wingnut Sequenzen
6 = neue PCR Komponenten mit neuem Primerpaar WG für Wingnut Sequenzen

Nun frage ich mich wo die Verunreinigung drin ist.
Meine Ergebnisse anhand Bild 2:
Primer: Können ausgeschlossen werden, da Probe 4 ohne Bande.
dNTPs: Können ausgeschossen werden, da sonst in allen Proben Banden wären.
neue / alte PCR Mastermix Komponenten: Können ausgeschlossen werden.
TaqPol: auch nicht
Wasser kanns ja auch nicht sein sonst wären ja überall Banden...

Also was nun?
Ich bin über jeden Hinweis dankbar bevor ich gezwungen bin alles zu ersetzen...
Bin ziemlich ratlos...
LG und Danke im Vorraus
 

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