PCR-Zyklen mit 53°C und 65°C ?

[Insulinashankss]

Hallo,

und zwar habe ich eine Frage zu den PCR-Zyklen (siehe eingefügtes Bild). Es wurden zunächst 5 Zyklen mit 53°C in der Primer-annealing Phase durchgeführt, danach 25 Zyklen mit 65°C. Wieso es 65°C beim Primer-annealing sein müssen ist mir klar, wieso muss man aber davor 5 Zyklen lang nur mit 53°C arbeiten.

Über eine konkrete Antwort würde ich mich sehr freuen

 

[Joffi]

Warum das konkret in Eurem Praktikum gemacht wurde, weiß ich natürlich nicht. Warum man das üblicherweise macht: Bei der Wahl der Annealingtemperatur ist man immer in einem Dilemma. Je näher man an die Schmelztemperatur der Primer herangeht (also je heißer), um spezifischer wird die PCR (weil man immer weniger falsche Primerbindungen bekommt), gleichzeitig kriegt man immer weniger Effizienz (auch die "richtige" Bindung ist stabiler, je kälter es ist). Also macht man gerne solche Kompromisse wie in Deinem Protokoll, wo man erstmal mit geringer Spezifität einen Haufen Produkt erzeugt und dann noch mal mit hoher Spezifität hinterhergeht, um aus dieser Suppe vieler richtiger und falscher Produkte genau das gewünschte Produkt selektiv herauszuamplifizieren.