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Restriktion. Hilfe ganz dringend benötigt!

Elsi

Moderator
Moderator
Ich schreib am Dienstag Klausur und soll da einen restriction digest (Keine ahnung wie das auf deutsch heißt) selber zusammenstellen. (genauer gesagt einen double digest)
Dazu muss ich bei gegebener Konzentration von DNA und Informationen über die Restriktionsenzyme den richtigen Puffer und die richtige Menge von Enzymen und Puffer ermitteln.
Damit ihr euch das besser vorstellen könnt: wir bekommen so eine Liste und sollen die ausfüllen:
DNA (2 microgramm/microliter) ... microliter
10X buffer ....... ... microliter (hier den richtigen buffer und das Volumen angeben)
KpnI (5units/microliter) ...microliter
SacI (5 units/microliter) ... microliter
Wasser (auf 30 microliter auffüllen)

Ich weiß, dass eine Unit im Enzym 1000 bp in einem microliter schneidet. (Glaub ich jedenfalls).
Wenn jetzt ein Vector eine Größe von 3500 bp hat und das Enzym hat 5U/microliter, dann bräuchte ich laut Dreisatz davon eigentlich 0,7 microliter, oder?
Wir sollen dann wohl auf einen microliter aufrunden, weil das realistischer ist als 0,7 microliter zu pippetieren.

Jetzt haben wir allerdings ein anderes Beispiel, in dem der Vector 6859 Bp groß ist.
Da müsste man ja theoretisch etwas über 1 Microliter nehmen (1.4)
Aber in einem Beispiel aus der Vorlesung haben wir auch einen Microliter genommen. Wird das einfach wieder abgerundet, oder haben wir da was falsch verstanden???

Bis auf das hab ich eigentlich alles verstanden, man muss mehr Enzym nehmen wenn es eine niedrigere Aktivität hat. Der Puffer wird nach dem dilution factor berechnet, der angegeben ist...
Aber das ist mir ein totales rätsel.
Ich hoffe ihr könnt euch vorstellen was für eine Aufgabe ich meine. Hört sich alles etwas wirr an.
 

Elsi

Moderator
Moderator
Okay, das Problem hat sich einigermaßen gelöst, weil mein Dozent auf meine Mail geantwortet hat.
Er hat unsere erste "Theorie" bestätigt, dass man immer einfach 5U auf 1microgramm DNA nimmt.

Jetzt haben wir aber noch ein anderes Problem. Wenn man das insert berechnet und im digest ausrechnen will wie groß sie Stücke werden, wie handhabt man denn die restriction sites? die eine Hälfte der Baasenpaare zum einen und die andere zum anderen? Was ist dann bei ungeraden restriction sites?
 

Joffi

Moderator
Moderator
Wie Du ja schon selbst rausgefuchst hast, ist die Größe des Vektors weniger erheblich als die DNA-Konzentration. Ganz korrekt gerechnet geht es natürlich um die Anzahl der Restriktionsstellen, also "Zahl Restr.Sites pro Molekül" mal "molare Menge". Aber das rechnet nie im Leben jemand aus sondern man bappt einfach gefühlsmäßig son µl Enzym und son µg DNA zusammen und hofft das beste :).
Zu Deiner Fragmentlängenfrage: Tja, hyperkorrekt müsste man angeben x Basen doppelsträngig plus y Basen Überhang (jedenfalls bei Enzymen, die Überhänge schneiden). Tut aber keiner außer wenn man wirklich auf die Base genau hin- und herklonieren will. Um Banden im Gel zu postulieren, sind 4 Basen mehr oder weniger völlig schnuppe, nimm einfach die Mitte der Schnittstelle.
 

Elsi

Moderator
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Vielen vielen Dank! :eek:
Dann hab ich mir das alles ja schon im Prinzip richtig gedacht. Hab nämlich auch überlegt, dass diese paar Basen eigentlich nicht so ins Gewicht fallen, aber da wir die Größe des Fragments mit angeben sollten waren wir etwas unsicher.Aber dann wird die Professorin ja hoffentlich auch nicht Punkte abziehen, wenn da eine Base zu viel oder zu wenig steht.
Du hast mir SEHR weitergeholfen! Wenn man darüber nämlich anfängt im Netz zu suchen findet man nie das, was man braucht (nämlich ne Erklärung) sondern immer nur Versuche in denen drin steht, dass man so und so viele units genommen hat.
 
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