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Sequenzanalyse Tra-Region Plasmid pIP501

Mareeenchen

Einfacher Mehrzeller
Hallo ihr Lieben,

In meiner Bachelorarbeit schreibe ich über konjugativen Plasmidtransfer in Gram-positiven Bakterien anhand des Plasmids pIP501. Ein Teil der Arbeit soll ein Versuchsaufbau werden bei welchem die tra-Regionen von pIP501 und dem Ti-Plasmid aus Agrobacterium tumefacien verglichen werden. Dazu müsste ich ja eine DNA-Sequenzierung durchführen, welche ich dann am PC auswerten kann. Es geht nur darum einen theoretischen Aufbau zu kreieren, ich kann leider nicht ins Labor wegen Covid. Meine Frage ist nun: Wie schaffe ich es denn, dass die DNA genau da geschnitten wird, wo die Tra-Regionen sich befinden? Geht das mit Enzymen, wenn ja wie usw? Ihr seht, ich bin leider überfordert. Meine Professorin meinte, dass es nicht mit Restriktionsenzymen gemacht wird sondern durch einen DNA-Sequenzvergleich der Plasmide am Computer. Verglichen werden dort die kodierten Tra-Gene. Leider verstehe ich nicht ganz genau was Sie meint. Könnt ihr mir helfen?
 

Felix fragt

Einzeller
Hi,

ich habe leider keine praktische Erfahrung damit und kann daher nur spekulieren, aber vielleicht hilft dir das ja, den zündenden Gedanken zu finden.
Vielleicht kannst du nach Zellaufschluss, DNA-Isolation und PCR eine Gelelektrophorese mit Southern Blot durchführen und die Sequenzen am Computer vergleichen. Dann müsste man für den Vergleich natürlich trotzdem irgendwie wissen, wo die Tra-Regionen sind :/ vielleicht beginnen die ja mit einer identischen eindeutigen Sequenz?

Ich drücke dir die Daumen!
 

cigouri

Säugetier: Eutheria

Der zweite Link ist ganz gut. Aber du musst das aber schon selbst lesen und rausfinden. Ich denke eher nicht, dass du selbst großartig was sequenzieren musst. Die Sequenzen sind bekannt, die kannst du auch BLASTen (Basic Local Alignment Tool, gratis und für jeden zugänglich! Das ist der dritte Link). Du scheinst wirklich etwas überfordert zu sein, Frag doch auch einfach mal deinen Betreuer. Der ist ja dazu da, dir behilflich zu sein. Du musst dich auch unbedingt über die molekularbiologischen tools zum Schneiden informieren ("klassische Restriktionsendonucleasen, CRISPR-cas, TALEN), da aus deiner Frage absolut nicht hervorgeht, um was es wirklich exakt geht, kann ich dir leider nicht viel weiter helfen. Will ich ehrlich gesagt auch nicht, denn das ist Deine Bachelorarbeit. :cool: Sequenzen für verschiedene Ti-Plasmide findest du sicher ebenfalls mit ein wenig Recherchierarbeit. Die Sequenz von pIP501 ist ebenfalls dokumentiert. Zum Beispiel hier. Ich denke/hoffe ihr habt über PubMed bzw. Elsevier Acces zum Full Text in eurem Institut, müsste aber eigentlich übers Institut gehen. Du kannst dann die Sequenzen ins BLAST kopieren und ein online Alignment machen. Eigentlich ziemlich easy.

 
zuletzt editiert:

Mareeenchen

Einfacher Mehrzeller
Danke für die Infos. Meine Betreuerin hat diese Paper geschrieben, ich habe sie bereits und sie ist auch super super hilfreich, ich möchte sie nur nicht dauernd nerven mit allem. Ich bin nicht grundsätzlich mit der Arbeit überfordert, ich habe bereits die Hälfte fertig. Ich habe mich gestern in Kontakt mit ihr gesetzt und nochmal Feedback angefragt. Vllt kann ich das Tool nutzen, dass sie als Link geschickt haben und damit etwas machen. Mit den Schneidetools hab ich mich auch auseinander gesetzt aber da werde ich keinen Schwerpunkt drauf legen, da es nicht so im Detail relevant ist für mein BA Thema.

Danke für die Links !
 

Mareeenchen

Einfacher Mehrzeller

Der zweite Link ist ganz gut. Aber du musst das aber schon selbst lesen und rausfinden. Ich denke eher nicht, dass du selbst großartig was sequenzieren musst. Die Sequenzen sind bekannt, die kannst du auch BLASTen (Basic Local Alignment Tool, gratis und für jeden zugänglich! Das ist der dritte Link). Du scheinst wirklich etwas überfordert zu sein, Frag doch auch einfach mal deinen Betreuer. Der ist ja dazu da, dir behilflich zu sein. Du musst dich auch unbedingt über die molekularbiologischen tools zum Schneiden informieren ("klassische Restriktionsendonucleasen, CRISPR-cas, TALEN), da aus deiner Frage absolut nicht hervorgeht, um was es wirklich exakt geht, kann ich dir leider nicht viel weiter helfen. Will ich ehrlich gesagt auch nicht, denn das ist Deine Bachelorarbeit. :cool: Sequenzen für verschiedene Ti-Plasmide findest du sicher ebenfalls mit ein wenig Recherchierarbeit. Die Sequenz von pIP501 ist ebenfalls dokumentiert. Zum Beispiel hier. Ich denke/hoffe ihr habt über PubMed bzw. Elsevier Acces zum Full Text in eurem Institut, müsste aber eigentlich übers Institut gehen. Du kannst dann die Sequenzen ins BLAST kopieren und ein online Alignment machen. Eigentlich ziemlich easy.


Und vllt noch kurz um etwas klar zu stellen:). Ich habe hier nicht darum gebeten, dass man für mich Paper liest oder mir mit meiner ganzen BA hilft sondern eine Teilfrage gestellt. Schließlich ist das hier ja ein Forum.
 
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