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Zellbasierter Assay führt zu sinkenden Signalen

Murinho_1

Invertebrat
Hallo,

ich führe momentan einen zellbasierten Assay durch bei dem der Zelltod detektiert wird, durch das Messen des Calcium Eintritts in die Zelle.
Ein Virulenzfaktor/Triton(bei der positiv Kontrolle) sorgen für eine Zerstörung der Zellmembran wodurch Calcium in die Zellen eintreten kann. Dieses Calcium wird benötigt um einen Farbstoff im Zellinneren zu aktivieren.

Leider ist es nun so, dass die Signale von Versuchstag zu Versuchstag sinken. Zuerst habe ich verschiedene Faktoren/Medien vermutet und diese verändert, leider ohne Erfolg. Der Signalverlust ist sowohl bei der Positivkontrolle wie auch bei dem Virulenzfaktor zu sehen.
Nach einer Durchführung des Assays konnte ich im Mikroskop sehen das die Zellen nicht lysiert waren. Sie waren morphologisch in einem sehr guten Zustand.
Das erklärt zumindest die extrem geringen Signale. Erwähnenswert hierbei ist, dass die Signale früher nahezu doppelt so hoch waren!

Jetzt weiß ich jedoch nicht warum eine solche Entwicklung möglich ist. Habe ich meine Zellen schlecht behandelt (falsch kultiviert)?
Die Zellen sind relativ neu in Kultur genommen worden, ich denke es müsste die 6-7 Passage sein, eigentlich sollten diese noch gut sein.
Können sich Resistenzen gegen 2 verschiedene Stoffe ausbilden?
Ich bin momentan wirklich am verzweifeln. Über Tipps/Hilfe würde ich mich freuen.

Grüße
Mourinho
 

Joffi

Moderator
Moderator
Hab ja schon drüben was geschrieben, aber hier noch mal was anderes: Es gibt dröfnfuffzig verschiedene, billige Nekrose-/Apoptose-Assays mit diversesten Mechanismen (Austritt verschiedener Enzyme wie LDH, DEAD-cell proteasen etc.; DNA-Färbung mit nicht-membrangängigem Farbstoff, Caspase-Aktivität etc.pp.) => ganz ehrlich, wenn ein selbstgeschraubter nicht sofort funzt, würd ich einfach einen kaufen (gibts für unter 1€/assay bei den üblichen Verdächtigen, will hier keine Werbung machen).
 
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