Polymerasekettenreaktion, PCR (engl. Polymerase Chain Reaction)
Was ist die PCR bzw. Polymerasekettenreaktion?
Die Polymerasekettenreaktion (kurz: PCR) dient als ein spezielles technisches Verfahren zum schnellen Vervielfältigen von DNA-Abschnitten. Mit dieser Technik lassen sich winzige Mengen von DNA (z. B. aus Speichelresten, einem eingetrockneten Tropfen Blut, einem Haar) millionenfach identisch vermehren, sodass schließlich genügend Material für eine weiterführende Untersuchung bereitsteht. Etwas salopp könnte man die Polymerasekettenreaktion als eine Art "Schnellkopierer" für DNA-Abschnitte bezeichnen.
Welches Problem hat die PCR gelöst?
Häufig liegen nur sehr geringe Mengen (Spuren) von DNA vor, die für eine Unterschung nicht ausreichen. Mit Hilfe der PCR ist es möglich, die Ausgangsmenge nach Bedarf zu vermehren, sodass die entsprechenden Unterschungen durchgeführt werden können.
Wer hat das PCR-Verfahren erfunden?
Erfunden hat diesen "Schnellkopierer" der amerikanische Chemiker Kary B. Mullis (geb. 1945). Die Polymerasekettenreaktion wurde 1989 als die bedeutendste Entdeckung des Jahres gefeiert, und Mullis erhielt 1993 den Nobelpreis für Chemie. Anwendung findet die Polymerasekettenreaktion unter anderem in der Gerichtsmedizin bzw. Forensik.
Wie erklärt sich der Name der PCR?
Der erste Bestandteil des Namens Polymerasekettenreaktion leitet sich von dem Namen des Moleküls ab, das den Kopiervorgang bzw. die Vervielfachung durchführt, der Polymerase (genauer: der DNA-Polymerase). Der zweite Bestandteil des Namens bezieht sich auf den Kopiervorgang, der so schnell wie eine Kettenreaktion abläuft. Geht man z. B. von nur 10 DNA-Molekülen aus, so dienen im 1. Kopiervorgang alle 10 als Kopiervorlage. Im 2. Durchgang stehen 20 Moleküle als Vorlagen zur Verfügung, sodass 40 neue Moleküle gebildet werden können, dann 80, 160, 320, 640 usw. Nach jedem "Zyklus" (siehe unten) hat sich die Zahl der gegebenen DNA-Matrizen (templates) verdoppelt, es kommt also zu einer exponenziellen Verfielfachung. Ein Zyklus benötigt im Labor heute nur wenige Minuten. (Üblicherweise liegt die Zahl der angewandten Zyklen im Labor zwischen 30 und maximal 40.)
In wie viele Schritte kann die PCR unterteilt werden?
Die Polymerasekettenreaktion lässt sich in 3 Schritte untergliedern, die zusammen einen Zyklus ("Kreisprozess") darstellen:
1. Schritt
Auftrennen des DNA-Doppelstrangs (Denaturierung der DNA)
Durch Erhitzen auf 94 Grad Celsius wird der vorliegende DNA-Doppelstrang (die Vorlage bzw. das "template") in Einzelstränge aufgetrennt.
2. Schritt
Anlagerung der Primer (Annealing, Hybridisierung)
Die Temperatur wird auf ca. 55 Grad Celsius abgesenkt, sodass sich die Primer (Starter, Oligonucleotide, PCR-Primer) an die DNA-Einzelstränge anlagern können. Die Primer besitzen normalerweise eine Länge von 18 bis 30 Basen.
3. Schritt
Bildung der neuen DNA-Einzelstränge durch Verlängerung der Primersequenzen (Elongation)
Die Temperatur wird auf die ideale Arbeitstemperatur für die verwendeten Polymerasen erhöht. Bei der Taq-Polymerase liegt dies Temperaturoptimum zwischen 72 und 74 Grad Celsius, sodass diese den Primer verlängern und damit den Doppelstrang vervollständigen kann.
An Schritt 1 schließen sich dann wieder die Schritte 1 bis 3 an. Durch die ständige Wiederholung dieser drei Schritte verdoppelt sich jedes Mal die Anzahl an kopierten DNA-Molekülen.
Sämtliche Schritte der Polymerasekettenreaktion werden heute in der Regel automatisiert in einem so genannten Thermozykler (auch PCR-Maschine genannt) durchgeführt. Thermozykler ermöglichen es, die notwendigen Temperaturwechsel mit hoher Zeitgenauigkeit vollautomatisch ablaufen zu lassen.
Welche Schwierigkeiten und Fehlerquellen gibt es?
Die Methode der Polymerasekettenreaktion weist allerdings derzeit auch noch bestimmte Schwierigkeiten auf. Zu nennen wären hier u. a. folgende Punkte:
 Um einen bestimmten Abschnitt einer DNA zu vervielfältigen, muss bereits ein Teil der Sequenz bekannt (sequenziert) sein, da sonst keine passenden Primer hergestellt werden können. Gänzlich unbekannte Gene können somit nicht vervielfältigt werden.
Die verwendete Taq-Polymerase besitzt (anders als die meisten anderen DNA-Polymerasen) keinen Korrekturlesemechanismus, sodass es vergleichsweise häufig, und zwar ca. alle 20 000 Basenpaare, zum Einbau eines falschen Nucleotids kommt.
Da mit äußerst geringen Mengen von DNA gearbeitet wird, kann es durch Verunreinigungen sehr leicht zu Fehlern kommen (nicht erwünschte DNA kann z. B. durch die Luft oder über die Haut des Laborpersonals in die Proben gelangen und so fälschlicherweise vervielfältigt werden).
Welche weiteren Anwendungen gibt es für die PCR in der Medizin?
Die PCR wird erfolgreich zum Nachweis sehr kleiner Mengen einer erkrankungsspezifischen Nukleotidsequenz eingesetzt. Die PCR hat daher zentrale Bedeutung für
- die Diagnostik,
- die Verlaufsbeurteilung einer minimalen Resterkrankung nach einer Therapie und
- die Einschätzung der Prognose.
Siehe auch unter:
 Template-DNA
Literatur:
Internet:
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