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rumpelstilzchen
Komplexer Mehrzeller
Hallo Leute,
ich habe ein Problem, das mich bald verzweifeln lässt. Ich versuche ein Fragment (1,2kb) in den Expressionsvektor pQE 70 Vektor (3,4kb) der Firma Qiagen zu klonieren. Dem Fragment wurde mittels PCR die Schnittstellen für BamHI und PaeI angehängt. Über diese beiden Schnittstellen soll es auch in den pQE Vektor kloniert werden. Die Fragmente wurden in den pGEM-T easy von Promega über A-T Klonierung zwischenkloniert.
Die Schnittstellen für BamHI und PaeI im Vektor sind durch 2 Basen voneinander getrennt. Da PaeI einen 5-Basenüberhang zum schneiden braucht verdaue ich den Vektor zuerst über Nacht in mit PaeI in BamHI-Puffer, inaktiviere dann PaeI, und verdaue dann 2h mit BamHI, da BamHI nur einen Basenüberhang zum schneiden braucht.
Das Insert verdaue ich per Doppelverdau aus dem pGEM-T Vektor, dann Standard Gelex, und dann Ligation im Verhältnis Vektor/Insert 1:5. Die Ligationen trage ich zusätzlich noch auf ein Gel auf. Es sind mehrere Banden zu sehen, was ja für eine geglückte Ligation spricht, und Vektor und Insert sind laut Gelbild auch im selben Verhältnis da. Ligasepuffer nehm ich auch immer frischen!
Dann transformiere ich in 50 µl chemokompetente DH5α 2-5µl der Ligation. Transformationsprotokoll nach Hanahan, also 30 min auf Eis stehen lassen, Hitzschock 90sec 42°C, SOB dazu, dann 45 min auf Schüttler 37°C und dann ausplattieren auf LB-Amp oder SOB-Amp.
Die Transformationseffizienz des leeren Vektors ist gut, will heissen 109 pfu/µg
Von den Ligationen bekomm ich max 20 Kolonien. So weit so gut!
Wenn ich jetzt Kolonien checke mit Verdau des Plasmids mit BamHI und PaeI hab ich entweder eine Bande bei 3,4kb (was ja dem Vektor entspricht) oder eine Bande bei 6kb. Beides ergibt keinen Sinn, da der Vektor nach Verdau mit BamHI und PaeI nicht religieren kann?!?!? Bande bei 6kb macht auch keinen Sinn, da die nur entstehen kann wenn zwei Inserts in den Vektor reinligiert wurden, was aber anhand der Schnittstellen nicht sein kann. Drei Inserts würden wiederum gehen, dann hätt ich aber eine Bande bei 7kb (3,4kb+1,2kb+1,2kb+1,2kb).
Hat jemand eine Ahnung was da los sein könnte? Oder weiss jemand über Klonierungsprobleme mit diesem pQE 70 Vektor zu berichten?
Hoffe jemand kann mir helfen und vllt. ein paar Tipps geben…
Vielen Dank schon mal!
ich habe ein Problem, das mich bald verzweifeln lässt. Ich versuche ein Fragment (1,2kb) in den Expressionsvektor pQE 70 Vektor (3,4kb) der Firma Qiagen zu klonieren. Dem Fragment wurde mittels PCR die Schnittstellen für BamHI und PaeI angehängt. Über diese beiden Schnittstellen soll es auch in den pQE Vektor kloniert werden. Die Fragmente wurden in den pGEM-T easy von Promega über A-T Klonierung zwischenkloniert.
Die Schnittstellen für BamHI und PaeI im Vektor sind durch 2 Basen voneinander getrennt. Da PaeI einen 5-Basenüberhang zum schneiden braucht verdaue ich den Vektor zuerst über Nacht in mit PaeI in BamHI-Puffer, inaktiviere dann PaeI, und verdaue dann 2h mit BamHI, da BamHI nur einen Basenüberhang zum schneiden braucht.
Das Insert verdaue ich per Doppelverdau aus dem pGEM-T Vektor, dann Standard Gelex, und dann Ligation im Verhältnis Vektor/Insert 1:5. Die Ligationen trage ich zusätzlich noch auf ein Gel auf. Es sind mehrere Banden zu sehen, was ja für eine geglückte Ligation spricht, und Vektor und Insert sind laut Gelbild auch im selben Verhältnis da. Ligasepuffer nehm ich auch immer frischen!
Dann transformiere ich in 50 µl chemokompetente DH5α 2-5µl der Ligation. Transformationsprotokoll nach Hanahan, also 30 min auf Eis stehen lassen, Hitzschock 90sec 42°C, SOB dazu, dann 45 min auf Schüttler 37°C und dann ausplattieren auf LB-Amp oder SOB-Amp.
Die Transformationseffizienz des leeren Vektors ist gut, will heissen 109 pfu/µg
Von den Ligationen bekomm ich max 20 Kolonien. So weit so gut!
Wenn ich jetzt Kolonien checke mit Verdau des Plasmids mit BamHI und PaeI hab ich entweder eine Bande bei 3,4kb (was ja dem Vektor entspricht) oder eine Bande bei 6kb. Beides ergibt keinen Sinn, da der Vektor nach Verdau mit BamHI und PaeI nicht religieren kann?!?!? Bande bei 6kb macht auch keinen Sinn, da die nur entstehen kann wenn zwei Inserts in den Vektor reinligiert wurden, was aber anhand der Schnittstellen nicht sein kann. Drei Inserts würden wiederum gehen, dann hätt ich aber eine Bande bei 7kb (3,4kb+1,2kb+1,2kb+1,2kb).
Hat jemand eine Ahnung was da los sein könnte? Oder weiss jemand über Klonierungsprobleme mit diesem pQE 70 Vektor zu berichten?
Hoffe jemand kann mir helfen und vllt. ein paar Tipps geben…
Vielen Dank schon mal!