Prinzip der Erzeugung transgener Organismen

[Shampoo7687]

Hallo!
Ich soll einein Vortrag halten über das Prinzip der Erzeugung transgener Organismen. Meine Frage ist ob es ein generelles Prinzip gibt oder ob ich die verschiedenen Methoden (z.B. Mirkoinjektion ect.) erklären soll. Meine Lehrerin kann ich leider nicht fragen, da ich sie bis ich den Vortrag halten soll nicht mehr sehe.
Eine weitere Frage wäre ob es bei der Mikroinjektion Vektoren gibt.

 

[Joffi]

Erst einmal kommt es darauf an, ob Du verschiedene organismische Systeme beleuchten willst. Die Herstellung transgener Baktierien läuft anders anders die Herstellung einer transgenen Maus oder Maispflanze. Deine Angaben deuten darauf hin, dass es Dir eher um die Maus geht, richtig?

 

[Shampoo7687]

Also ich soll irgendwie das Prinzip erklären anhand von verschiedenen Beispielen. Auf dem Zettel meiner Lehrerin stehen Drosophila, Hefen, Knock-Out Mäuse und "Dolly" drauf, wobei ich glaube, dass ich weitere Beispiele nehmen soll.
Zuerst dachte ich, dass es vieleicht ein generelles Prinzip gibt transgene Organsimen herzustellen. Ich dachte das genrelle Prinzip wäre die DNA mit Restiktionsenzymen zu teilen, diese in Vektoren überführen und diese Vektoren in eine Wirtzelle einzugliedern und nun dachte ich dass es verschiedene Variationen von diesem grundlegenden Prinzip gibt. Also dass bei den verschiedenen Methoden andere vektoren verwendet werden usw. Leider sehe ich keinen Vektor bei der Methode der Mikroinjektion und deshalb meine Frage ob es überhaupt ein grundlegendes Prinzip gibt.

 

[Joffi]

Hmm, streng genommen würde ich "Dolly" gar nicht transgen nennen, das Vieh ist einfach geklont. Und hier kommt eben die Mikroinjektion in Frage.

Ein kurzer Abriß über die Technik bei Maus: Man nehme Mäuse-Stammzellen und transfiziere die mit einem Vektor, so dass die Stammzellen die gewünschte Veränderung tragen. Die Stammzellen injiziere man in eine Blastozyste und implantiere sie in eine Maus. Der Nachwuchs ist dann "gescheckt" aus ursprünglich Blastozystenzellen und ursprünglich Stammzellen. Man finde Mäuse, bei denen die Veränderung die Keimzellen betrifft und kreuze sie weiter, fertig. (Anmerkung: Da hab ich jetzt bewusst einige Dinge weggelassen ums kurz zu machen. Wenn Du´s genauer wissen willst, frag)

 

[Shampoo7687]

Ja ich hab mich auch schon gewundert warum ich Dolly beschreiben soll.
Aber gibt es nun so ein grundlegendes Prinzip? Bei der Sache mit den Stammzellen ist ja alles vorhanden, aber was ist mit der Mikroinjektion (nicht bei Dolly sondern z.B. bei Tracy)
Und zu der Veränderung der Stammzellen: Wenn ich in die Stammzellen die fremde DNA übertrage, welche Methoden kann ich da benutzen? Nur Elektoporation oder auch andere? Wenn ja welche (brauchst die mir nicht zu erklären, nur aufzählen)?

 

[Joffi]

Um Zellen in Kultur zu transfizieren steht Dir einiges zur Verfügung:
-Calcium-Phosphat-Methode (DNA wird in Kristalle eingeschlossen und endocytiert)
-Lipofectamin und verwandte (DNA in Liposomen)
-Viren (selbsterklärend)
-Elektroporation (klar)
-Partikelkanone (DNA klebt an Nano-Goldkügelchen und wird in die Zellen geschossen)

 

[Shampoo7687]

Okay vielen Dank!
Sag mal kannst du mir sagen wie das mit der homologen Rekombination funktioniert? Ist das das selbe wie eine intrachromosomale Rekombiantion??

 

[Joffi]

Homologe Rek. ist ursprünglich ein Mechanismus zur DNA-Reparatur (z.B. von Strangbrüchen). Die Zelle nutzt die unbeschädigte Kopie, um eine beschädigte nach dieser Vorlage zu reparieren. Das kann man dann technisch ausnutzen, indem man eine intakte Vorlage vorgaukelt, die dann manchmal verwendet wird.

 

[Shampoo7687]

Okay jetzt gehen bei mir einige Lichter auf.
Ich habe trotzdem noch einige Fragen (wieder zu einem anderen Thema (zu Drosophila nämlich)):
Also man holt sich (von wo her denn?) Transposons, welche besondere Endsequenzen aufweisen und mit Hilfe eines Enzyms (Transposase) an einer beliebigen Stelle in das Genom der Fliege integriert werden können. Nun rahmt man die Fremd-DNA, die man transfizieren möchte, zwischen diesen Endsquenzen ein und injiziert die veränderten Transposons (= Vektoren) in das Embyro der Fliege ein. Gleichzeitig injiziert man auch das Gen für das die Transposase ein, welcher nur einmalig (oder kurzzeitig??) das veränderte Transposon spezifisch in den Keimzellen integriert. Nun gehen erst in der nächsten Generation sichtbare transgene Tiere hervor.

So könntest du bitte gucken ob das so richtig ist und mir die zwei Fragen in den Klammern beantworten? Tut mir leid wenn ich nerve...

 

[Joffi]

Klingt gut, wie es ist.
Zum woher: Nun, nachdem man einmal herausgefunden hat, welche Erkennungssequenzen die Transposase hat, kann man die wahlweise aus einem entsprechenden, genomischen Ort klonieren und verwenden oder einfach synthetisieren. In der Praxis kauft man sich wohl eher einfach einen kommerziellen Vektor, wo die Dinger schon drauf sind und man nur noch seine Wunsch-DNA dazwischen klonieren muss.
Zur Dauer: Man könnte schlicht einen Vektor verwenden, der nicht ins Genom integriert wird. Irgendwann wird der als Fremd-DNA von der Zelle zerstört, hat aber bis dahin ordentlich Transposase bauen lassen.

 

[Shampoo7687]

Und nochmals vielen vielen Dank.
Leider hab ich noch eine (kleine) Frage: wie erzeugt man typischerweise transgene Hefen? Oder was meinst du warum das da auf meinem Blatt stand? Irgendwie finde ich nämlich nicht viel Nützliches...

 

[Joffi]

Tja, irgendwann stösst dann jeder an seine Grenzen, ich find Pilze doof
Aber gefühlsmäßig würde ich stark auf Elektroporation tippen.

 

[Shampoo7687]

Haha! Ja okay kein Problem, ich werd das schon irgendwie machen.
Also vielen Dank für die ganzen Antworten bisher!

 

[Shampoo7687]

Uhm.. vielleicht wäre da noch eine Kleinigkeit:
was ist der Unterschied zwischen Chimären und der Mosaikform?

 

[Joffi]

Da wird manchmal ein bißchen durcheinander verwendet. Ich würde eigentlich sagen, eine Chimäre ist sozusagen eine Mosaikform auf zellulärer Ebene: Also ein "gemischter" Chromosomensatz in jeder Zelle. Im Unterschied dazu hat die Mosaikform ja in jeder Zelle nur entweder den einen ODER den anderen. Aber wie gesagt, dass wird manchmal auch anders verwendet: Man findet z.B. oft auch den Ausdruck Chimäre für gescheckte Mäuse, die eigentlich eine Mosaikform aus zwei Mausstämmen ist.

 

[Shampoo7687]

Achso, gut alles klar!

 

[Shampoo7687]

Mal wieder eine Frage:
Bei der retroviralen Infektion werden ja nicht alle Embyronenzellen gleichermaßen befallen, sodass Mosaikformen enstehen. Aber warum verwendet man nicht einfach besamte Eizellen wie bei der Mirkoinjektion oder man lässt Eizelle und Samenzelle einzeln befallen und führt diese später künstlich zusammen , sodass ja dann keine Mosaikformen entstehen?
Und kann man die Methode mit den Transposons nur bei Insekten verwenden?

 

[Joffi]

Eine Samenzelle kann man mit einem gängigen Retrovirus nicht infizieren, da das Erbgut darin inaktiv in einer Art Lagerform vorliegt und nicht zugänglich ist. Aber meines Wissen nach ist es ohnehin keine gängige Methode, einen Embryo so zu infizieren. Ich kenne das so: Man infiziert Stammzellen in Kultur, selektioniert dann auf erfolgreiche Klone, lässt davon einen wieder hochwachsen und injiziert einige dieser Zelle in eine Blastozyste (ab da gehts weiter wie unten beschrieben) => Mosaik.

 

[Shampoo7687]

Okay danke dann wäre das geklärt. Und kann man die Methode mit den transposons nur bei Insekten anwenden??

 

[Denis]

Okay danke dann wäre das geklärt. Und kann man die Methode mit den transposons nur bei Insekten anwenden??

Selbstverständlich kann man die Methode bei jedem gen anwenden, das man erforscht hat. Drosophila ist halt nun mal DER Modellorganismus für Genetik.

Gruss
Denis